案例分析5重实验,查找ldquo
3+岁时肌电图：双下肢周围神经病损，远端神经受累为主，合并上肢远端神经受累。头颅MRI及智力测试未见异常。CK、CKMB等未见异常。
9岁查体发现卷发，无明显特殊面容，双手无通贯掌，双上肢肌力可，肌张力稍高，下肢肌张力高，行走呈跨阈步态，扁平足，行走稍有不稳，稍有共济失调。
面对上述情况，临床医生该怎么办？01
患儿所患何病？TrioWES来揭秘
对于此种情况，临床通常采用全外显子组检测（WES）技术，作为查找致病原因的突破点，遂对患者及父母进行TrioWES家系全外显子组检测。
TrioWES检测结果显示，患儿携带一个“纯合”变异——GAN基因1号外显子发生c.7delC移码变异。
根据ACMG指南，提示发生在GAN基因的c.7delC（exon1）为致病性变异，致病性评级证据包括：PVS1（移码突变）+PM（人群低频）+PP4（疾病症状相符）。GAN基因变异可导致什么疾病？
GAN基因变异可导致巨轴索神经病，这是一种罕见的常染色体隐性遗传（AR）的慢性神经退行性疾病，主要累及中枢和周围神经系统的感觉与运动神经，由于大量中间纤维（intermediateflaments,IFs）的异常聚集而引起神经元轴突肿胀的病理特征而得名。患儿的临床表型与巨轴索神经病高度相符吗？
对于巨轴索神经病，OMIM数据库记录的临床表型如下：此外，巨轴索神经病患者在出生时及儿童早期发育正常，3-5岁左右开始发病。
可见，患者的临床表型与GAN基因变异相关的巨轴索神经病高度相符。
0
意外！患儿“纯合”变异，母亲却为野生型...
对于常染色体隐性遗传（AR）遗传病，患儿为“纯合”变异，理论上父母应分别携带一个GAN基因的c.7delC（exon1）变异。然而，TrioWES检测结果显示，患儿父亲为杂合型，患儿母亲为野生型。也就是说，先证者的其中一个致病位点是父源的。那么，另外一个是怎么来的？■是新发变异的c.7delC?
■是存在包含c.7delC在内的大片段缺失？
■还是......03
5重实验，查找变异“真凶”
为了探究患者详细的致病机制，来自医院的石妹珍老师，采取了一系列验证实验。一、qPCR：首先采用qPCR实验，来验证先证者基因组内GAN基因的拷贝数。实验结果显示，先证者发生了包含GAN基因1号外显子的缺失和1号外显子上游10Kb处的缺失，即发生了两处大片段缺失。另外一个问题，摆在我们面前。
缺失后基因组是否发生了重排？重排的序列是什么样的？
二、长片段PCR
根据qPCR结果，我们设计了3对长片段PCR引物，进行进一步验证。
这3对引物跨越了正常基因组＞7Kb以上，正常情况下，是无法扩增出序列的。只有发生了缺失之后，才会有序列的扩增。
从跑胶图可以看出，这3对引物，只有患者扩增出了特异性片段，产物大小为4Kb左右。
三、Sanger测序
对扩增片段进行Sanger测序，测序结果显示，在第一处缺失部位发生了大约56kb的缺失，并在缺失部位插入了bp反向序列。
第二处包含GAN基因1号外显子的序列缺失了5kb，并插入了互补链序列的1.3kb左右，但鉴于测序的中间为乱峰序列，无法确定确切的序列。
那乱峰是怎么产生的呢？四、TA克隆对乱峰序列进行TA克隆，TA克隆测序结果显示，乱峰之所以出现，是因为患者基因组发生了多种复杂重排序列的嵌合。那么，这些重排产生的机制是？
对患者基因组进行分析，发现患者基因组内包含至少5种复杂重排序列的嵌合，并且不同断裂连接点的介导机制可能各不相同。
五、淋巴细胞转录水平验证
患者基因组内的变异如此复杂，那么上述基因组异常到底会不会致病呢？
使用患者淋巴细胞进行qPCR试验，检测GAN基因的转录水平。
实验结果显示，相较于正常人，患者的GAN基因转录水平降低了70%左右；相较于携带者父亲，患者GAN基因的转录水平降低了50％，进一步明确了GAN基因的致病性。
04
病例小结
先证者并不是简单的“纯合”移码变异，而是遗传自父亲的移码变异与新发复杂重排序列的复合杂合致病。并且，患者基因组内有多种复杂重排序列的嵌合。专家点评姜玉武医院
这个案例相对来说比较复杂，石妹珍老师从临床资料的收集到变异位点的致病性评级分析都十分清晰，并且经过了一系列的实验对结果进行验证，遗传学层面的研究非常完整和详细。
在临床方面，针对巨轴索神经病，还需要收集更多的经典临床症状，补充更多的临床证据。遗传病的诊断特别强调从临床和遗传两个方面进行检测结果的综合判断，互相印证，最终做出诊断。这个病例告诉大家，在遗传病检测结果分析时，要根据遗传病的遗传模式和表型分离情况进行比对，出现不能解释的情况时，应想到一些特殊情况，如是否有新发变异、杂合性缺失等情况，必要时咨询遗传专业医生和医学遗传学基础专家，与检测机构合作进行进一步深入分析。
本案例由来自医院的石妹珍老师，通过“倍道兼行·瑞彩新生全外案例大赛”提供，感谢石妹珍老师的分享，更多精彩详情可点击观看下方视频↓↓↓
本期案例竞猜获奖用户名单：JoeyLau/凯/Toby谭请以上三位老师后台与我们联系，并留下通信地址，方便工作人员寄送礼物。往期回顾
第五期案例竞猜
活泼健康的孩子，突然走路不稳。是怎么了？
第四期案例分析打破三代遗传的家族魔咒，竟是因为……案例竞猜
祖孙三代皆患眼疾！如今再孕，是延续家族命运？or另获新生？第三期案例竞猜
前胎早夭，再度NT增厚，究竟偶然还是另有隐情？
案例分析
步步求证，反复“NT增厚”的背后故事
第二期
案例竞猜岁幼儿，住院4次，诊断明确、规范化治疗，但病情反复。why?
案例分析
检测结果扭转！竟然是因为医生做了这件事！
第一期案例竞猜多出的“Y”去哪儿了？案例分析
关于“Y”消失的四大疑团喜欢我，请点在看哦预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
